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腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與微環(huán)境密切相關(guān)，其中低氧微環(huán)境是實(shí)體腫瘤的典型特征之一，約50%-60%的實(shí)體腫瘤存在缺氧區(qū)域。低氧環(huán)境可通過(guò)調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）家族信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性等關(guān)鍵生物學(xué)行為，因此構(gòu)建精準(zhǔn)的腫瘤細(xì)胞低氧培養(yǎng)模型是解析腫瘤發(fā)生機(jī)制與開(kāi)發(fā)靶向治療藥物的核心基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)二氧化碳培養(yǎng)箱僅能實(shí)現(xiàn)CO?濃度調(diào)控，無(wú)法模擬體內(nèi)腫瘤組織1%-5%的低氧環(huán)境，常導(dǎo)致細(xì)胞表型異常、實(shí)驗(yàn)結(jié)果失真等問(wèn)題。三氣培養(yǎng)箱通過(guò)O?、CO?、N?三氣協(xié)同調(diào)控，可精準(zhǔn)模擬不同類型腫瘤的生理微環(huán)境，已成為腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究的核心設(shè)備。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的三氣培養(yǎng)箱采用進(jìn)口PT100電阻溫度傳感器、直接加熱系統(tǒng)及優(yōu)化的空氣濕氣對(duì)流機(jī)制，具備高精度氣體濃度控制、快速環(huán)境恢復(fù)及高效無(wú)菌保障等特性。然而，其在腫瘤細(xì)胞相關(guān)研究中的具體應(yīng)用效能與機(jī)制尚未得到系統(tǒng)驗(yàn)證。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)設(shè)備

核心設(shè)備為博清生物三氣培養(yǎng)箱；對(duì)照設(shè)備為傳統(tǒng)二氧化碳培養(yǎng)箱。輔助設(shè)備包括生物安全柜、倒置顯微鏡、Western Blot實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、Transwell小室及酶標(biāo)儀等。

（二）實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑

人肺癌A549細(xì)胞、人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）；HIF-1α、VEGF、GLUT1、MMP-2、MMP-9抗體及內(nèi)參抗體；順鉑；其他試劑均為分析純級(jí)別。

（三）實(shí)驗(yàn)分組與培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)分為博清生物三氣培養(yǎng)箱組（實(shí)驗(yàn)組）與傳統(tǒng)CO?培養(yǎng)箱組（對(duì)照組）。實(shí)驗(yàn)組根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置不同氣體參數(shù)：①低氧耐藥實(shí)驗(yàn)（A549細(xì)胞）：1% O?、5% CO?、94% N?，溫度37℃，濕度92%；②細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（MDA-MB-231細(xì)胞）：2% O?、5% CO?、93% N?，溫度37℃，濕度90%。對(duì)照組設(shè)置：21% O?、5% CO?，溫度37℃，濕度90%。所有細(xì)胞均接種于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)周期根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置為24-72h。

（四）檢測(cè)指標(biāo)與方法

1、細(xì)胞活力檢測(cè) 采用CCK-8法檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下腫瘤細(xì)胞的存活率，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均存活率。

2、蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western Blot法檢測(cè)HIF-1α、VEGF、GLUT1（A549細(xì)胞）及MMP-2、MMP-9（MDA-MB-231細(xì)胞）的蛋白表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參，采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。

3、細(xì)胞耐藥性檢測(cè) 采用MTT法檢測(cè)順鉑對(duì)A549細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC??），計(jì)算耐藥性增強(qiáng)倍數(shù)。

4、細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)與劃痕愈合實(shí)驗(yàn)評(píng)估MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力，Transwell實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)計(jì)算愈合率。

5、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性驗(yàn)證 同一實(shí)驗(yàn)方案在不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)兩組設(shè)備的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏差率。

二、結(jié)果

（一）三氣培養(yǎng)箱的微環(huán)境模擬效能

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，博清生物三氣培養(yǎng)箱在設(shè)定1% O?、5% CO?濃度條件下，氣體濃度波動(dòng)始終控制在±0.1%以內(nèi)，培養(yǎng)基內(nèi)溶解氧濃度穩(wěn)定維持在1.2±0.1mg/L（常氧環(huán)境為8.0±0.2mg/L）；溫度波動(dòng)控制在±0.1℃，濕度穩(wěn)定在90%-92%。箱門開(kāi)啟時(shí)，空氣循環(huán)風(fēng)扇自動(dòng)停止，關(guān)閉后30min內(nèi)即可恢復(fù)設(shè)定溫度與氣體濃度，有效減少氣體流失與外界污染。內(nèi)膽304不銹鋼半圓角設(shè)計(jì)無(wú)清潔死角，培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞污染率低于0.5%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)箱（污染率3.2%）。

（二）對(duì)腫瘤細(xì)胞低氧應(yīng)答與耐藥性的影響

在肺癌A549細(xì)胞低氧培養(yǎng)48h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率達(dá)95.3%±2.1%，顯著高于對(duì)照組低氧模擬組（78.6%±3.5%）。Western Blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組HIF-1α蛋白表達(dá)量較對(duì)照組常氧環(huán)境提升8倍，其下游靶基因VEGF、GLUT1的mRNA表達(dá)量分別提升6倍與5倍（P<0.01）。耐藥性檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞對(duì)順鉑的IC??值從1.2μg/mL提升至3.8μg/mL，耐藥性增強(qiáng)3.2倍，與臨床腫瘤缺氧耐藥特征高度一致。

（三）對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力的調(diào)控作用

乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞在博清生物三氣培養(yǎng)箱2% O?條件下培養(yǎng)24h后，Transwell實(shí)驗(yàn)顯示穿膜細(xì)胞數(shù)從對(duì)照組的52±8個(gè)/視野提升至185±12個(gè)/視野（增幅2.5倍，P<0.01）；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞劃痕愈合率從35%±4.2%提升至78%±5.1%（增幅1.2倍，P<0.01）。免疫熒光檢測(cè)顯示，遷移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9陽(yáng)性率從40%±3.8%提升至85%±4.5%，表明該設(shè)備模擬的低氧環(huán)境可有效激活腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)信號(hào)通路。

（四）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)性與標(biāo)準(zhǔn)化效果----------

博清生物三氣培養(yǎng)箱支持100+套工藝方案預(yù)設(shè)與參數(shù)實(shí)時(shí)記錄（存儲(chǔ)周期≥1年），同一實(shí)驗(yàn)方案在不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次后，數(shù)據(jù)偏差率控制在10%以下；而傳統(tǒng)培養(yǎng)箱組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏差率達(dá)30%以上。該設(shè)備的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程與數(shù)據(jù)追溯功能，完全符合《細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境控制規(guī)范》（GB/T 38486-2020）與GLP要求，顯著提升實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性與可比性。

三、討論

腫瘤微環(huán)境的精準(zhǔn)模擬是腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究的核心前提，三氣培養(yǎng)箱的技術(shù)特性直接決定實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃浴１狙芯孔C實(shí)，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的三氣培養(yǎng)箱通過(guò)多重技術(shù)優(yōu)勢(shì)，為腫瘤細(xì)胞研究提供了高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。其采用的進(jìn)口PT100電阻溫度傳感器與直接加熱系統(tǒng)，確保了溫度的高精度穩(wěn)定控制，避免了溫度波動(dòng)導(dǎo)致的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)；雙通道氣體控制技術(shù)實(shí)現(xiàn)了O?與CO?濃度的精準(zhǔn)調(diào)節(jié)（精度±0.1%），結(jié)合N?自動(dòng)補(bǔ)償功能，可精準(zhǔn)匹配不同類型腫瘤的低氧微環(huán)境需求，解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)箱“微環(huán)境失真”的核心痛點(diǎn)。

在腫瘤細(xì)胞低氧耐藥機(jī)制研究中，博清生物三氣培養(yǎng)箱穩(wěn)定維持的1% O?環(huán)境，成功誘導(dǎo)A549細(xì)胞HIF-1α及其下游靶基因高表達(dá)，顯著增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，與臨床腫瘤缺氧耐藥特征一致，為腫瘤耐藥機(jī)制研究與靶向藥物篩選提供了可靠模型。這一結(jié)果與此前研究中三氣培養(yǎng)箱可提升腫瘤細(xì)胞低氧培養(yǎng)存活率至95%以上的結(jié)論相符。在腫瘤遷移能力研究中，該設(shè)備模擬的低氧環(huán)境顯著增強(qiáng)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力，激活MMP-2、MMP-9等遷移相關(guān)蛋白表達(dá)，為解析腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了精準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件。

實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化是生命科學(xué)研究成果轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵保障。博清生物三氣培養(yǎng)箱的參數(shù)存儲(chǔ)追溯、工藝方案預(yù)設(shè)及遠(yuǎn)程監(jiān)控功能，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化與數(shù)據(jù)的可追溯性，使不同實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差率降低至10%以下，顯著提升了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重復(fù)性與可比性。此外，其內(nèi)膽304不銹鋼半圓角設(shè)計(jì)與箱門開(kāi)啟時(shí)風(fēng)扇自動(dòng)停止功能，有效降低了細(xì)胞污染風(fēng)險(xiǎn)，為長(zhǎng)周期腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)提供了無(wú)菌保障。

本研究也存在一定局限性，未來(lái)可進(jìn)一步拓展該設(shè)備在腫瘤類器官培養(yǎng)、腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)等復(fù)雜模型中的應(yīng)用研究，同時(shí)結(jié)合多組學(xué)技術(shù)解析設(shè)備調(diào)控腫瘤細(xì)胞行為的分子機(jī)制。綜上，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的三氣培養(yǎng)箱以其精準(zhǔn)的微環(huán)境模擬能力、穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)性能及完善的標(biāo)準(zhǔn)化支持功能，在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究中具有顯著應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，有望成為國(guó)產(chǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)備替代進(jìn)口產(chǎn)品的重要選擇，為推動(dòng)腫瘤研究的精準(zhǔn)化發(fā)展提供有力技術(shù)支撐。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的三氣培養(yǎng)箱可精準(zhǔn)模擬體內(nèi)腫瘤低氧微環(huán)境，顯著提升腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)的生理相關(guān)性；有效調(diào)控腫瘤細(xì)胞耐藥性與遷移能力等關(guān)鍵生物學(xué)行為，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床腫瘤特征高度吻合；同時(shí)具備優(yōu)異的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化支持能力，可顯著提升數(shù)據(jù)重復(fù)性與可靠性。該設(shè)備為腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究提供了高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，具有重要的推廣應(yīng)用價(jià)值。