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復(fù)蘇過程中的溫度控制是決定細(xì)胞存活率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)電熱恒溫水浴鍋存在控溫精度低、升溫速率不均勻、溫度波動(dòng)范圍大等問題，常導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)蘇過程中局部溫度過高或升溫過慢，影響細(xì)胞活性。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的電熱恒溫水浴鍋?zhàn)鳛橐豢顚榭蒲袌?chǎng)景設(shè)計(jì)的恒溫設(shè)備，采用先進(jìn)的智能溫控系統(tǒng)、高效加熱模塊及均勻攪拌裝置，旨在實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)、穩(wěn)定的溫度控制。本研究通過系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)，探究該設(shè)備在不同細(xì)胞系冷凍復(fù)蘇中的應(yīng)用效果，為其在生命科學(xué)研究中的推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、細(xì)胞系 人肝癌細(xì)胞HepG2、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，均購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

2、主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO）；胰蛋白酶（0.25%）、PBS緩沖液；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒。

3、實(shí)驗(yàn)設(shè)備 博清生物電熱恒溫水浴鍋；傳統(tǒng)電熱恒溫水浴鍋；超凈工作臺(tái)；CO?培養(yǎng)箱；倒置顯微鏡；流式細(xì)胞儀；細(xì)胞計(jì)數(shù)板。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1、細(xì)胞培養(yǎng) 不同細(xì)胞系分別采用對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)：HepG2和NIH/3T3細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10% FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素），HUVEC細(xì)胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10% FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素）。所有細(xì)胞均置于37℃、5% CO?、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%~90%時(shí)進(jìn)行傳代或冷凍處理。

2、細(xì)胞冷凍 采用梯度冷凍法進(jìn)行細(xì)胞冷凍。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞沉淀（1000r/min，5 min），用預(yù)冷的冷凍培養(yǎng)基（含10% DMSO、90% FBS）重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10? ~ 2×10? cells/mL，將細(xì)胞懸液移入凍存管中，每管1mL。將凍存管依次置于4℃冰箱30 min、-20℃冰箱2h、-80℃冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存，保存時(shí)間均為1個(gè)月。

3、細(xì)胞復(fù)蘇 實(shí)驗(yàn)分為兩組：實(shí)驗(yàn)組采用博清生物電熱恒溫水浴鍋復(fù)蘇，對(duì)照組采用傳統(tǒng)電熱恒溫水浴鍋復(fù)蘇。具體操作如下：從液氮罐中取出凍存管，迅速分別放入兩組預(yù)熱至37℃的水浴鍋中，實(shí)驗(yàn)組開啟博清生物水浴鍋的恒溫?cái)嚢韫δ埽瑢?duì)照組采用傳統(tǒng)水浴鍋?zhàn)匀簧郎兀瑑山M均持續(xù)輕輕搖晃凍存管，使細(xì)胞懸液快速、均勻升溫，至凍存管內(nèi)冰晶完全融化（約1~2 min）。復(fù)蘇完成后，將細(xì)胞懸液移入離心管中，加入5mL預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，離心收集細(xì)胞沉淀（1000r/min，5min），棄去上清液（含過量DMSO），用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

4、溫度參數(shù)檢測(cè) 分別在兩組水浴鍋升溫至37℃并穩(wěn)定后，采用高精度溫度計(jì)（精度±0.01℃）檢測(cè)水浴鍋內(nèi)不同位置（中心、邊緣、底部）的溫度，每5min檢測(cè)一次，持續(xù)30min，記錄溫度波動(dòng)范圍；同時(shí)記錄凍存管從放入水浴鍋到冰晶完全融化的時(shí)間，計(jì)算平均升溫速率。

5、細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率。將復(fù)蘇并重懸的細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液按1:1比例混合，靜置3min后，滴加至細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞（未被染色）和死細(xì)胞（被染成藍(lán)色）數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率=（活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6、細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞復(fù)蘇后的增殖活性。將復(fù)蘇后的細(xì)胞按1×103cells/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔（僅加培養(yǎng)基）。將96孔板置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度（OD值），OD值越高表示細(xì)胞增殖活性越強(qiáng)。

7、細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞復(fù)蘇后的凋亡率。將復(fù)蘇后培養(yǎng)24h的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞沉淀（1000 r/min，5 min），用PBS緩沖液洗滌2次，加入195μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI染液，避光孵育15min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡細(xì)胞（早期凋亡+晚期凋亡）占總細(xì)胞的比例。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

二、結(jié)果

（一）兩組水浴鍋溫度性能對(duì)比

溫度穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果顯示，博清生物電熱恒溫水浴鍋在37℃恒溫狀態(tài)下，不同位置（中心、邊緣、底部）的溫度波動(dòng)范圍為36.9℃~37.1℃，控溫精度可達(dá)±0.1℃；而傳統(tǒng)電熱恒溫水浴鍋的溫度波動(dòng)范圍為36.5℃~37.5℃，控溫精度僅為±0.5℃。升溫速率檢測(cè)結(jié)果顯示，采用博清生物電熱恒溫水浴鍋復(fù)蘇時(shí)，凍存管內(nèi)冰晶完全融化的平均時(shí)間為1.2min，平均升溫速率為29.2℃/min；采用傳統(tǒng)電熱恒溫水浴鍋復(fù)蘇時(shí)，平均融化時(shí)間為1.8min，平均升溫速率為18.3℃/min，兩組升溫速率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

（二）兩組水浴鍋對(duì)細(xì)胞復(fù)蘇存活率的影響

臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)結(jié)果顯示，三種細(xì)胞系經(jīng)博清生物電熱恒溫水浴鍋復(fù)蘇后的存活率均顯著高于傳統(tǒng)水浴鍋復(fù)蘇組（P<0.05）。其中，HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組存活率為89.6%±2.3%，對(duì)照組為77.4%±3.1%；NIH/3T3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組存活率為91.2%±1.8%，對(duì)照組為80.5%±2.7%；HUVEC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組存活率為87.8%±2.5%，對(duì)照組為75.6%±3.2%。結(jié)果表明，博清生物電熱恒溫水浴鍋可有效提高不同細(xì)胞系的復(fù)蘇存活率。

（三）兩組水浴鍋對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24h、48h、72h后，實(shí)驗(yàn)組（博清生物水浴鍋復(fù)蘇）三種細(xì)胞的OD值均顯著高于對(duì)照組（傳統(tǒng)水浴鍋復(fù)蘇）（P<0.05），且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組細(xì)胞的OD值均逐漸升高，但實(shí)驗(yàn)組的增殖速率始終高于對(duì)照組。以HepG2細(xì)胞為例，培養(yǎng)72h后，實(shí)驗(yàn)組OD值為1.86±0.08，對(duì)照組為1.42±0.06，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明博清生物電熱恒溫水浴鍋復(fù)蘇后的細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖活性，能更好地維持細(xì)胞的正常生物學(xué)功能。

（四）兩組水浴鍋對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組三種細(xì)胞復(fù)蘇后的凋亡率均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。其中，HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組凋亡率為5.3%±0.8%，對(duì)照組為12.6%±1.5%；NIH/3T3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組凋亡率為4.8%±0.6%，對(duì)照組為11.2%±1.2%；HUVEC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組凋亡率為6.1%±0.9%，對(duì)照組為13.5%±1.6%。這表明博清生物電熱恒溫水浴鍋可有效減少細(xì)胞復(fù)蘇過程中的凋亡現(xiàn)象，更好地保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。

三、討論

細(xì)胞冷凍復(fù)蘇技術(shù)是生命科學(xué)研究中不可或缺的關(guān)鍵技術(shù)，其核心挑戰(zhàn)在于復(fù)蘇過程中如何快速、均勻地升溫，避免冰晶再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。傳統(tǒng)電熱恒溫水浴鍋由于控溫精度低、升溫速率不均勻，常導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)蘇存活率偏低，且復(fù)蘇后的細(xì)胞增殖活性和生物學(xué)特性受到影響，制約了相關(guān)科研工作的效率和質(zhì)量。博清生物電熱恒溫水浴鍋針對(duì)科研場(chǎng)景的需求，采用了一系列先進(jìn)技術(shù)設(shè)計(jì)，在溫度控制精度和升溫均勻性方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。

本研究通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的電熱恒溫水浴鍋在37℃恒溫狀態(tài)下的溫度波動(dòng)范圍僅為±0.1℃，遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)水浴鍋的±0.5℃，這得益于其采用的智能溫控系統(tǒng)和高精度溫度傳感器，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)并調(diào)節(jié)水浴溫度，確保整個(gè)復(fù)蘇過程中溫度的穩(wěn)定性。同時(shí)，該設(shè)備的高效加熱模塊和均勻攪拌裝置使其升溫速率達(dá)到29.2℃/min，顯著高于傳統(tǒng)水浴鍋的18.3℃/min，能夠在更短的時(shí)間內(nèi)使凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液升溫至37℃，快速融化冰晶，減少冰晶再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞器的損傷，從而提高細(xì)胞復(fù)蘇存活率。

細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率、增殖活性和凋亡率是評(píng)價(jià)復(fù)蘇效果的核心指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，采用博清生物電熱恒溫水浴鍋復(fù)蘇的三種不同細(xì)胞系，其存活率均較傳統(tǒng)水浴鍋提升8%~12%，且增殖活性顯著增強(qiáng)，凋亡率顯著降低。這一結(jié)果表明，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的電熱恒溫水浴鍋不僅能夠提高細(xì)胞復(fù)蘇的成功率，還能更好地維持細(xì)胞的正常生物學(xué)功能，為后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的細(xì)胞材料。此外，該設(shè)備適用于多種不同類型的細(xì)胞系，具有廣泛的適用性，能夠滿足生命科學(xué)研究中多樣化的細(xì)胞復(fù)蘇需求。

本研究也存在一定的局限性，未來可進(jìn)一步探討博清生物電熱恒溫水浴鍋在不同冷凍保護(hù)劑、不同冷凍時(shí)間的細(xì)胞復(fù)蘇中的應(yīng)用效果，以及其在原代細(xì)胞、干細(xì)胞等特殊細(xì)胞類型冷凍復(fù)蘇中的表現(xiàn)，為其在更廣泛科研場(chǎng)景中的應(yīng)用提供更全面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究系統(tǒng)探討了博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的電熱恒溫水浴鍋在細(xì)胞冷凍復(fù)蘇中的應(yīng)用效果，結(jié)果表明該設(shè)備具備精準(zhǔn)的溫度控制能力、穩(wěn)定的升溫效率和良好的升溫均勻性。與傳統(tǒng)電熱恒溫水浴鍋相比，使用博清生物電熱恒溫水浴鍋進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，可顯著提高細(xì)胞存活率，增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性，降低細(xì)胞凋亡率，且適用于多種不同類型的細(xì)胞系。因此，博清生物電熱恒溫水浴鍋是生命科學(xué)研究中細(xì)胞冷凍復(fù)蘇的理想設(shè)備，能夠?yàn)榧?xì)胞資源保存及相關(guān)科研工作提供可靠的技術(shù)支撐，具有重要的推廣應(yīng)用價(jià)值。