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熒光定量技術通過特異性熒光染料與靶蛋白的結合反應實現定量，其靈敏度和選擇性顯著優于傳統方法。博清生物科技（南京）有限公司研發的熒光計作為一款緊湊型檢測設備，采用特異性熒光探針技術，可實現微量核酸與蛋白質的快速定量，其核心優勢包括樣品消耗量少、檢測速度快及抗干擾能力強等特點。

一、 材料與方法

（一）實驗材料

1、儀器：博清生物熒光計；對照熒光計；紫外分光光度計；電子天平；微量移液器。

2、試劑：熒光標記蛋白標準品（FITC-BSA，分子量66 kDa，純度≥98%）；熒光標記蛋白檢測試劑盒；BSA標準品；常見干擾物（NaCl、SDS、Triton X-100、游離FITC染料）。

3、耗材：低吸附離心管（1.5mL）；無菌無酶吸頭（0.1~10μL、10~100μL、100~1000μL）；儀器配套比色皿。

（二）實驗方法

1、標準曲線制備

精確稱量FITC-BSA標準品，用PBS緩沖液（pH7.4）配制濃度為1mg/mL的儲備液，梯度稀釋為0.05、0.1、1、10、50、100、200ng/μL的標準系列溶液。按照博清生物熒光計檢測試劑盒說明書，取1μL標準溶液與199μL工作液（染料與緩沖液按1:200比例混合）充分混勻，室溫避光孵育3分鐘后，插入儀器檢測倉進行熒光信號讀取。以標準品濃度為橫坐標，相對熒光單位（RFU）為縱坐標，采用二次曲線擬合建立標準曲線，計算回歸方程及相關系數（R2）。

2、方法學驗證

線性范圍與檢出限：對0.05~200ng/μL的FITC-BSA標準系列進行檢測，每個濃度設置6個平行樣，以R2≥0.995的濃度范圍為有效線性范圍；以3倍空白信號標準差（3SD）對應的濃度為檢出限（LOD），10倍空白信號標準差（10SD）對應的濃度為定量限（LOQ）。

精密度：選取低（1ng/μL）、中（50ng/μL）、高（150ng/μL）三個濃度的FITC-BSA樣品，每個濃度設置8個平行樣，進行單次批內檢測；連續5天進行批間檢測，計算變異系數（CV）。

特異性與抗干擾性：在10ng/μL FITC-BSA樣品中，分別加入不同濃度的干擾物，檢測干擾物對定量結果的影響，以誤差≤±5%為抗干擾合格標準。同時，對比博清生物熒光計與紫外分光光度計對含游離FITC的混合樣品的檢測結果。

3、實際樣品檢測

選取3組經熒光標記的目標蛋白（GFP融合蛋白、Cy3標記抗體、Alexa Fluor 647標記抗原），分別采用博清生物熒光計、對照熒光計及紫外分光光度計進行定量檢測，每個樣品設置3個平行樣，比較三種方法的檢測結果一致性。

二、結果與分析

（一）標準曲線與線性范圍

博清生物熒光計對FITC-BSA的檢測標準曲線呈現良好的二次擬合關系，回歸方程為 y=0.032x2+5.87x+12.3（R2=0.9992），有效線性范圍為0.1~200ng/μL，覆蓋了大部分熒光標記蛋白實驗的常用濃度區間。檢出限（LOD）為0.05ng/μL，定量限（LOQ）為0.15ng/μL，顯著低于傳統紫外吸收法（LOD≈1 ng/μL），表明該儀器對低濃度熒光標記蛋白具有更高的檢測靈敏度。

（二）精密度驗證

批內與批間精密度結果顯示，低、中、高三個濃度樣品的批內CV分別為1.8%、1.2%、0.9%，批間CV分別為2.9%、2.1%、1.7%，均低于5%的行業標準，表明該方法的重復性良好，檢測結果穩定可靠。

（三）特異性與抗干擾性

抗干擾實驗結果表明，當NaCl濃度≤300mmol/L、SDS濃度≤0.5%、Triton X-100濃度≤2%時，博清生物熒光計的檢測結果誤差均≤±3.5%，且對游離FITC染料（≤5μg/mL）無明顯響應，而紫外分光光度計在含0.5μg/mL 游離FITC的樣品中檢測誤差高達28.7%。這一結果證實，博清生物熒光計通過特異性熒光染料與蛋白質的結合反應，可有效排除游離染料及常見污染物的干擾，檢測特異性顯著優于紫外吸收法。

（四）實際樣品檢測對比

對3組實際熒光標記蛋白樣品的檢測結果顯示，博清生物熒光計與對照熒光計的檢測值無統計學差異（P>0.05），而紫外分光光度計的檢測值普遍偏高（誤差12.3%~27.5%），主要原因是其無法區分蛋白結合熒光與游離熒光。此外，博清生物熒光計的單次檢測時間僅需3~5分鐘，樣品消耗量僅1μL，較對照系統（樣品量2μL，檢測時間5~8分鐘）更具高效性和經濟性。

三、討論

熒光標記蛋白的定量分析面臨兩大核心挑戰：低濃度樣品的精準檢測與復雜基質中的特異性識別。本研究建立的博清生物熒光計檢測方法，通過以下技術優勢解決了上述問題：其一，采用高特異性熒光染料，僅與蛋白質結合后發射熒光信號，有效排除游離染料、鹽離子及去污劑等干擾，這與對照系統的檢測原理一致，但在抗干擾濃度閾值上更具優勢（如耐受2% Triton X-100，高于對照系統的1%）；其二，儀器光學系統的高靈敏度設計使檢出限低至0.05ng/μL，滿足了微量珍貴樣品（如免疫沉淀產物、活體組織提取蛋白）的定量需求；其三，簡化的操作流程（無需復雜樣品預處理，孵育時間≤3分鐘）及低樣品消耗量（1~20μL），顯著提升了實驗效率并降低了成本。

在實際應用中，標準曲線的制備質量是影響熒光定量準確性的關鍵因素。本研究通過嚴格控制試劑新鮮度、同批次處理標準品與樣品、確保R2≥0.998等措施，有效降低了系統誤差。此外，博清生物科技（南京）有限公司研發的熒光計的緊湊型設計使其適用于移動實驗室或現場檢測場景，而其兼容多種熒光標記（FITC、Cy3、Alexa Fluor 系列等）的特性，進一步拓展了應用范圍。

與現有技術相比，本方法的局限性在于對高濃度樣品（>200ng/μL）需進行稀釋處理，且檢測結果依賴于專用試劑盒的特異性。未來可通過優化染料配方與儀器光學參數，進一步拓寬線性范圍，并開發針對不同修飾類型熒光標記蛋白的專用檢測模塊，以滿足更復雜的實驗需求。

本研究成功建立了基于博清生物熒光計的熒光標記蛋白定量分析方法，該方法具有線性范圍寬（0.1~200ng/μL）、檢出限低（0.05ng/μL）、精密度高（CV<3.1%）及特異性強等優點，可有效排除游離熒光染料及常見污染物的干擾。與傳統紫外吸收法及商用熒光定量系統相比，博清生物科技（南京）有限公司研發的熒光計在檢測效率、樣品消耗量及抗干擾能力上更具優勢，適用于蛋白質組學研究、生物制藥質量控制、臨床診斷等多個領域。該方法的建立為熒光標記蛋白的精準定量提供了新的技術選擇，具有重要的科研價值與應用前景。